DAX1 (transcriptie factor)

Een van de factoren die het vrouwelijke genotype bepalen is Dax1. Dax1 (= dosage-sensitive seks reversal, adrenal hyperplasia, X-linked) is een orphan nucleaire receptor en het is gedupliceerd in Denys-Drash syndroom (je krijgt dan XY geslachtsreversie, zij worden dus vrouw). De functie van Dax1 is waarschijnlijk het onderdrukken van Sox9 en andere ongepaste mannelijke genen in de vrouw. Dax1 komt tot in expressie in de indifferentie gonade en daarna alleen nog maar in het ovarium. Dax1 is een transcriptiefactor en behoort tot de nucleaire hormoon receptor familie. Wat bindt er nou aan deze transcriptiefactoren? Liganden: steroïden (zoals oestrogenen, progesteron, androgenen, glucocorticoiden en mineralocorticoiden); retinoine zuren; vetzuren; prostaglandinen; thyroid hormonen; leukotrienen; onbekend  orphan receptoren. Van Dax1 is er dus nog niet duidelijk wie er aan bindt. Normaal is het zo dat Dax1 Sox9 remt, waardoor je geen mannelijke genen krijgt, en in het geval van een XY met Dax1 duplicatie remt SRY Dax1, maar door de extra dosis Dax1 wordt Sox9 toch geremd en krijg je ook een vrouw, doordat de gonaden zich niet ontwikkelen. Dus in een normale man remt SRY Dax1.

Functionele disomie = beide Dax1 genen zijn actief, dit kan ontstaan door een translocatie van de korte arm van chromosoom X. Wnt4 (= glycoproteine)

Dit signaaleiwit (van de Wingless familie) is essentieel bij de ovarium ontwikkeling. Bij te veel Wnt4 (genduplicatie) krijg je XY geslachtsreversie. Wnt4 selectedert Dax1. Verder leidt SRY (Sox9?) tot downregulatie van Wnt4 en Dax1. Het mannelijke en vrouwelijke houden elkaar dus in evenwicht.

De vrouwelijke gonaden (testis) en afvoerbuizen (buis van Wolff is gedifferentieerd) lijken sterk op de mannelijke in Wnt4 knockout muizen -> geslachtsreversie. Daarnaast zie je de buis van Wolff bij kleuring van Pax2, dus het bevindt zich niet alleen in de nier en ureter. R-spondin1 werkt samen met Wnt4, samen zorgen ze tot ophoping van beta catenine. Zo kan Dax1 worden afgeschreven.

Dit leidt dus tot een goede ontwikkeling van de vrouw. Door mutaties in R-spondin1 krijg je XX geslachtsreversie. Familie F: door een guanine insertie krijg je een frameshift en daardoor een stopcodon na 10 aminozuren. Sporadische mutatie AN: homozygote deletie van 2752 baseparen -> geen exon 4 -> geen normale isoform van RSPO1 en verminderde expressie van beta catenine. Zonder R-spondin1 kun je niet goed ontwikkelen tot vrouw.

AMH (zowel endocriene als paracriene factor)

Anit-Mullerian hormoon, deze zorgt voor de regressie van de buis van Muller in de man. Dit hormoon wordt uitgescheiden door de Sertoli cellen. Het is een cel signalerend eiwit en behoort tot de TGF familie. De expressie van AMH wordt gereguleerd door sox9, wt1, sf1 en GATA4. AMH kan via de bloedbaan ook in de buis van een mogelijk tweede embryo komen, dit komt door de gedeelde bloedvoorziening. In dat geval wordt de buis van Muller in een XX embryo afgebroken door de AMH van het XY embryo.

Als er een mutatie in de Amhr2 receptor of in de Bmpr1a receptor zit, wordt de buis van Muller niet afgebroken, er is dan sprake van AMH receptor deficiëntie!!

AMH bindt aan de AMH-receptor waardoor het MMP2 gen wordt afgeschreven en je MMP2 (matrix-metalloprotease )krijgt. Hierdoor regresseert de buis van Muller. Totaalplaatje:

Toevoeging: SRY remt dus Wnt4 en Dax1 en Dax1 remt Sox9. Verder remmen beta catenine en sox9 elkaar.

Geslachtsdeterminatie door de eeuwen heen, deze heeft nogal een verandering doorgaan: 335 v. Chr.: Aristoteles

Vrouwen zijn mannen waarvan de ontwikkeling vroegtijdig is gestopt t.g.v. de koude baarmoeder die het hete sperma teveel heeft afgekoeld. 190 n. Chr.: Galen - 1543 n. Chr.: Vesalius

Vrouwen zijn slecht ontwikkelde mannen met binnenste buiten gekeerde geslachtsdelen. 1600 - 1900:

Een vrouw is een vrouw en geen man! En omgevingsfactoren bepalen het geslacht. 1900 - 2000: (Geslachts)chromosomen (en omgeving) bepalen het geslacht.

Het geslacht, de gonaden, ontstaat in het intermediare mesoderm. De gonade ontstaat mediaal van de mesonephros!! Bij 6 weken spreek je van een bipotentieel geslachtsprimordium, het kan nog alle kanten op. Je ziet ook de buis van Muller die geïnduceerd wordt door de buis van Wolff. Door de Amhr2 receptor te kleuren kun je gonaden in kaart brengen. Cre activiteit is beperkt tot de gonaden en de buizen van M. Stuvia.com - De Marktplaats voor het Kopen en Verkopen van je Studiemateriaal Gelachtsdeterminatie: primair = de bepaling van de gonaden; secundair = de bepaling van het fenotype buiten de gonaden.

Geslachtskenmerken: primair = kenmerken bij de geboorte; secundair = kenmerken in de puberteit.

Het overzicht van de geslachtsdeterminatie (= belangrijk):

Secundair is dus dat het ovarium en de testis hormonen gaan aanmaken en vanaf daar verder. Vanaf 4 weken heb je het gonade kiemepitheel, vanaf 6 weken dus het bipotentieel primordium en vanaf 7 weken begint de differentiatie in ovarium of testis. Dit alles kan bij de mens onderzocht worden m.b.v. geslachtsreversies en steriele patiënten.

Secundaire geslachtbepaling in zoogdieren

Wanneer je de gonaden uit een konijnenembryo haalt dan ontwikkelen mannetjes en vrouwtjes zich allemaal tot vrouwtje, je laat altijd buizen van Muller tot ontwikkeling komen. Je ziet geen penis en bijbehorende mannelijke structuren. De testis is daarom heel belangrijk en is nodig voor de ontwikkeling van de mannelijke geslachtskenmerken (testosteron) en voor de regressie van vrouwelijke structuren (AMH).

De geslachtsbepaling in het dierenrijk verschilt per diersoort. Zo wordt het geslacht van een krokodil bepaald door de incubatie temperatuur van het ei.

Als je Lhx9 mist dan wordt er geen gonade gemaakt. Je hebt eerst wel een normale aanleg van het gonade kiemepitheel. Dus dit is nodig voor de specificatie!! Maar in de mutanten is geen sprake van proliferatie van het gonade kiemepitheel en er worden uiteindelijk ook geen gonaden aangemaakt als Lhx9 mist. Verder zijn Lim1, Emx2, Sf1 en Wt1 essentieel voor de specificatie van de indiffernte gonade. Bij mutaties in Lhx9, Lim1, Emx2 en Wt1 ontstaan helemaal geen gonaden; bij mutaties in Emx2, Sf1 en Wt1 begint de ontwikkeling van de gonaden wel, maar stop dan en regresseert.

Stel dat het wel goed gaat en je bipotentieel primordium krijgt, wat dan. De primaire geslachtsbepaling wordt bepaald doordat mannen XY hebben en vrouwen XX. Vrouwen die maar 1 X hebben, die hebben het Tuner syndroom, en die zijn vrouwelijk. 47 XXY  Klinefelter syndroom, deze individuen zijn mannelijk. Je kunt nu concluderen dat het Y chromosoom bepaalt dat je een man wordt, hoeveel Xen je ook hebt. Oftewel het Y chromosoom codeert voor de testis determining factor (TDF). XY vrouwen en XX mannen hebben toch ergens een stukje Y, de TDF ligt op de korte arm van Y chromosoom, dit is al genoeg om man te worden. Het gen dat voor de 35 kb regio codeert is het SRY gen (= sex determining region of the Y chromosome). SRY deletie = een XY vrouw. SRY translocatie = een XX man. Als je het SRY gen hebt, dan wordt je de mannelijke richting opgestuurd. SRY transgenen XX muizen ontwikkelen zich als mannen (testes, bijbehorende mannelijke organen en penis), maar deze vrouwtjes zijn steriel. Als je twee XX hebt dan remt dat de spermatogenese, dus met SRY kun je niet helemaal een man maken, er zijn ook andere delen van het Y chromosoom voor nodig.

SRY is een DNA bindende eiwit het behoort tot de HMG eiwitten. Deze eiwitten ontvouwen de dubbele helix en maken er een knik in. Dit kan de transcriptie beïnvloeden, maar het kan ook betrokken zijn bij de RNA processing (splicen). Dit laatste is niet zo belangrijk. Dus we weten nu dat SRY leidt tot de vorming van de testis, maar wat is er nog meer? SRY is essentieel voor migratie van de mesonephros cellen naar de gonade (deze gaan daar bijdragen aan de verdere ontwikkeling). Ze hebben muisjes genomen van 12 dagen, ze bevatten ofwel SRY ofwel niet. Uit deze muisjes wordt het urogentiaal rudiment gehaald, dus de gonaden en de mesonephros worden uit elkaar gehaald. Na het kweken zie je dan dat de gonade blauw kleurt, dus er zijn cellen van de mesonephros in de gonaden gekropen bij muizen met het SRY gen. Dit is dus nodig om een goede testis te maken. Als je FGF9 uitschakelt dan krijg je XY geslachtsreversie. Is er een verband bij de migratie van de mesonephroscellen naar de gonaden? Ze hebben nu alleen vrouwtjes gebruikt (inderdaad geen migratie), maar bij toevoeging van FGF9 zagen ze wel migratie, dus dit kan zelfs zonder SRY, FGF9 neemt dan zijn functie over. Dus FGF functioneert de downstream van SRY, hij kan het gebrek van SRY overkomen. FGF9 heeft verschillende functies: proliferatie en differentiatie van Sertoli voorlopercellen (precursors); celmigratie van mesonephros endotheel cellen naar de testis; organiseren van Sertoli cel precursors tot testis strengen; vorming van de grote testis slagader.

SRY komt alleen in zoogdieren voor (dus het is niet evolutionair geconserveerd). Verder zijn er ook veelvuldig XY geslachtsreversies zonder mutaties in het SRY gen aangetoond. Wat zit er upstream SF1 en ..? Wat zit er nog meer downstream FGF9 en ..? Of loopt er misschien nog iets parallel aan deze pathway? Sox9 (transcriptie factor)

Dit is een nieuwe mannelijke factor die ontdekt werd. Dit gen is heel erg belangrijk bij botvorming. Maar daarnaast zie je ook in 75% van de XY patiënten een geslachtsreversie van de XY. Verder is gevonden dat als je een duplicatie hiervan krijg in XX ook geslachtsreversie krijgt. Het gen is autosomaal (nr. 17) en evolutionair geconserveerd in vertebraten. Sox9 is de centrale figuur, deze moet zorgen voor de mannelijke richting. Sox9 induceert de testis ontwikkeling in XX transgene muizen. Bij een Sox9 mutatie in XY krijg je juist een vrouwtje. Sox9 wordt onder andere gereguleerd door SRY. Samen met SF1 bindt SRY aan het DNA, waardoor Sox9 geselectederd wordt. Sox9 autoreguleert zichzelf (dus drie manieren!).

De plaats van FGF9 is hierdoor wel wat onduidelijker, maar hij zit sowieso achter SRY. De SRY expressie begint in het centrum van de gonade en verspreidt zich dan door gehele gonade = dynamisch “center-to-pole” patroon. Sox9 (4 uur later) gaat ook helemaal over de gehele gonade, dan trekt SRY zich terug en heb je alleen nog maar Sox9.

Achtergrond casus 2a

Het gaat hierbij om de ontwikkeling van de nier (metanephros). Vrij caudaal in de ductus mesonefricus krijg je de ureterknop. De eerste stap is de formatie van het metanefros mesenchym (de differentiatie), de volgende stap is de inductie van de ureterknop (GDNF wordt gemaakt onder invloed van Pax2 en Hox11, het wordt afgegeven en induceert de knop door te binden aan zijn RET receptor). ROBO2 (receptor) en SLIT2 (ligand) zorgen ervoor dat GDNF afgifte geblokkeerd wordt in de craniale regio van de buis van Wolff. Wat gebeurt er als je ROBO2 of SLIT2 uitschakelt? Dan krijg je een heleboel ureterknoppen en later meerdere ureters! Er zijn mensen bekend die kunnen overleven met deze mutatie.

Hoe gaat de ontwikkeling nu verder? De vierde stap is de aggregatie van mesenchymale cellen, rond de knopjes gaan allemaal cellen zich groeperen, Wnt9b selectedert Wnt4, waardoor dus die groepjes ontstaan. De volgende stap is de vorming van nefronen, ook hierbij is Wnt4 belangrijk (is autocrien) middels MET. Stap 6 is de vertakking van de ureterknop, daarvoor zijn GDNF, RET en Wnt11 belangrijk, Wnt11 zorgt er weer voor dat er weer meer GDNF wordt afgegeven.

Pax2 (transcriptie factor) en Wnt4 (paracrien) worden uitgebreid behandeld, ze spelen beide een belangrijke rol bij de nierontwikkeling. Pax2 komt tot uiting in nefrogeen mesenchym (NM), ureter-knop (UB) en buis van Wolff (WD). Wnt4 komt tot uiting in het condenserend mesenchym (CM), en bij vorming van de nefronen. Is er een verband tussen deze twee eiwitten? Pax2 selectedert de expressie van Wnt4 in condenserend mesenchym, zodat je daar die nefronen krijgt. De expressie van Wnt4 zie je enorm toenemen als je Pax2 toevoegt aan de cellen. Bij minder Pax2 zie je niet of nauwelijks Wnt4. Dus het is aangetoond met twee verschillende experimenten.

Cystic Fibrosis (CF, ook bekend als taaislijmziekte of ‘salty-baby disorder’) is een autosomaal recessief overervende genetische ziekte. De gemiddelde levensverwachting van CF-patiënten is ongeveer 37 jaar. Ongeveer 1 op de 2500 mensen is CF-patiënt en 1 op de 25 mensen (1/√625) is drager. Een aantal van de belangrijkste symptomen van CF:

• Hoog zoutgehalte in zweet (herkomst van de benaming ‘salty-baby disorder’),
• Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD), Verstopping van de dunne darm,
• Alvleesklierenzymen-deficiëntie, Onvruchtbaarheid bij mannen (CBAVD: ‘Congenital
• Bilateral Absence of the Vas Deferens’).

Structuur en werking van het CFTR-eiwit

Het gen verantwoordelijk voor CF codeert voor het CFTR-eiwit (‘CF transmembrane conductance regulator protein’). Het gen bevindt zich op de lange arm van chromosoom 7, is 250 kilobases lang en bevat 27 exons (figuur 1a). Het normale genproduct is opgebouwd uit 1480 aminozuren en bevat twee transmembrane domeinen die elk zes keer door het membraan gaan (TMD1 en TMD2, figuur 1b). Bovendien bevat het eiwit twee nucleotide binding domains (NBD1 en NBD2, figuur 1b) waar ATP gebonden kan worden. Tot slot is een R-domein aanwezig (figuur 1b), wat gefosforyleerd kan worden door protein kinase A en C, wat de activiteit van het eiwit (op nog onbekende wijze) kan regelen.

Het CFTR-eiwit vormt een ion channel voor chloride ionen, waarbij transport van de ionen altijd met het concentratiegradiënt mee plaatsvindt. Het ATP wordt in dit geval dus niet gebruikt voor actief transport, maar om het kanaal te openen en te sluiten. De hydrolyse van ATP is dus, in tegenstelling tot de ATP-hydrolyse in normale ABC-transporters, niet direct stoichiometrisch gekoppeld aan het transport van ionen. Figuur 2 geeft de werking van het CFTR-eiwit weer in vijf fasen.



Genetische achtergrond

In CF-patiënten bevat het CFTR-gen een deletie van drie nucleotiden, wat als gevolg heeft dat het CFTR-eiwit één aminozuur korter is dan in gezonde mensen. De nucleotidesequentie die verwijderd wordt is CTT, hierdoor verdwijnt de phenylalanine op plaats 508 (de deletie wordt daarom ook wel aangeduid als ΔF508). Het is echter niet het phenylalanine-codon zelf wat uit het gen verwijderd is (figuur 3), maar het is een deletie van de C afkomstig van het isoleucine-codon (ATC) en de TT afkomstig van het phenylalanine-codon (TTT). Het nieuwe ontstane codon (ATT) codeert ook weer voor isoleucine, met als effect verwijdering van phenylalanine en behoud van isoleucine.

De deletie bevindt zich in het NBD1-domein van het eiwit. Het is gebleken dat het korter worden van het eiwit (en niet zo zeer het specifiek missen van de phenylalanine) bepalend is voor de ziekte; het vervangen van de phenylalanine op plaats 508 door bijvoorbeeld een cysteïne, heeft namelijk geen ziekteverschijnselen tot gevolg. Verwijderen van de isoleucine op plaats 507 geeft echter zeer vergelijkbare symptomen, wat aantoont dat inderdaad het korter worden van het eiwit het ziektebeeld veroorzaakt en dat dit niet per se de phenylalanine hoeft te zijn. Het ingekorte eiwit kan niet in de juiste conformatie vouwen, waardoor het snel afgebroken wordt (klasse-II mutatie). Behalve de ΔF508- mutatie kunnen ook een aantal missense en nonsense mutaties CF veroorzaken (o.a. G542X, G551D, N1303K en W1282X). Deze mutaties zijn echter vele malen zeldzamer dan de phenylalanine deletie. Omdat de ΔF508-mutatie zo frequent voorkomt in het menselijk genoom, is het aannemelijk dat deze mutatie ooit in de geschiedenis van de mens evolutionair voordeel heeft gehad (positieve selectie). Mogelijk ging de mutatie gepaard met resistentie tegen een (nu uitgestorven) ziekte, op vergelijkbare wijze als dat sikkelcelanemie gepaard gaat met malaria-resistentie.

CFTR-functie in context: hoog zoutgehalte in zweet

Zweet van gezonde mensen bevat een zeer laag chloorgehalte. Terwijl het zweet door het buisje van de zweetklier naar het huidoppervlak wordt getransporteerd, worden de chloride ionen namelijk heropgenomen door de epidermiscellen (figuur 4a). Het CFTR-eiwit zorgt hierbij voor passief transport van chloride ionen uit het zweet terug naar de epidermiscellen. In CF-patiënten is het CFTR afwezig of niet functioneel, waardoor chloor niet heropgenomen wordt door de cellen (figuur 4b). Het zweet van CF-patiënten heeft hierdoor een hoog zoutgehalte.

CFTR-functie in context: taai slijm in de longen

In gezonde longen transporteert CFTR chloride ionen uit de cellen naar de mucus die het epitheel van de luchtwegen bedekt (figuur 5a). De oplopende concentratie chloor in de mucus vormt een drijvende kracht voor osmose. De mucus neemt hierdoor water op, waardoor de structuur van het slijm de juiste viscositeit behoudt. Bij niet-functionerend CFTR zal het chloride-ionentransport niet plaatsvinden. Als gevolg hiervan zal het slijm niet voldoende gehydrateerd worden, waardoor het een taaie structuur aanneemt (figuur 5b). Het taaie slijm gaat gepaard met chronische infectie van de longen en COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease).

CFTR-functie in context: verstopping van de dunne darm

In de dunne darm vindt veel watertransport plaats van de darmepitheelcellen naar mucus in het lumen. Transport van chloride naar het lumen creëert in gezonde darmen een osmotisch gradiënt, op vergelijkbare wijze als hoe dit in de longen gebeurt. Niet-functionerend CFTR zorgt voor opbouw van taaie mucus in de darm, waardoor verstoppingen op regelmatige basis plaatsvinden.

CFTR-functie in context: alvleesklierenzymen-deficiëntie

Behalve in het celmembraan komen de CFTR-kanalen ook voor in het lysosoommembraan, waar ze mede verantwoordelijk zijn voor de pH-regulatie. Import van H+ houdt de pH in de lysosomen laag, waardoor eiwitafbraak kan plaatsvinden. Het chloride wordt hierbij als tegenion gebruikt. In afwezigheid van een chloride ion kanaal, zal het lysosoommilieu niet zuur genoeg zijn, waardoor eiwitten niet altijd op het juiste moment worden afgebroken. Vooral in de alvleesklier is gebleken dat deze verkeerde zuurgraad tot enzymdeficiënties kan leiden. Ook is de processing van bepaalde enzymen in het Golgi systeem vaak verstoord.

CFTR-functie in context: onvruchtbaarheid bij mannen (CBAVD)

In 99% van de mannelijke CF-patiënten wordt vaak ook onvruchtbaarheid (CBAVD: ‘Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens’) geconstateerd. Vanwege het ontbreken van het CFTR-eiwit, kunnen de zaadkanalen (vas deferens) zich niet ontwikkelen. Mogelijk raken de vas deferens tijdens hun ontwikkeling verstopt door taaie mucus, waardoor ze al in een vroeg stadium afgebroken worden. Er zijn ook CBAVD-patiënten bekend die wel een mutatie in het CFTR-gen hebben, maar (behalve onvruchtbaarheid) geen symptomen van CF vertonen.

CF vanuit een klinisch perspectief

De gevolgen van de ΔF508-mutatie kunnen mogelijk behandeld worden met butyraat, wat de verkeerde vouwing van het CFTR corrigeert. Gene transfer is een andere potentiële therapie die ook de andere, minder voorkomende, mutaties kan complementeren.